生物学论文_鸡Chemerin基因的真核表达载体构建
文章摘要:Chemerin是由脂肪组织分泌的脂肪因子，可以调节脂肪细胞的代谢和免疫应答等生物学过程。本研究以鸡（Gallus gallus）肝脏组织总RNA为模板，采用逆转录PCR （reverse transcription PCR, RT-PCR）和cDNA末端快速扩增（rapid amplification of cDNA ends, RACE）方法获得鸡的Chemerin基因全长cDNA序列，应用qPCR检测鸡Chemerin基因mRNA在不同组织中的表达情况；构建Chemerin-Myc真核融合表达载体并转染LMH （Leghorn male hepatoma）细胞，用Western blot检测Chemerin-Myc融合蛋白表达情况；通过启动子片段截短实验，构建双荧光素酶报告基因载体，检测鸡Chemerin基因不同长度启动子片段的转录效率。结果表明，成功克隆鸡Chemerin基因，其cDNA全长为733 bp，编码162个氨基酸，其中5’UTR长度为55 bp,3’UTR长度为189 bp;Chemerin基因主要在肝脏、肾脏和脂肪组织中表达；成功构建真核融合表达载体pCMV-3Tag-9-gga-chemerin-Myc，转染鸡LMH细胞后，经Western blot检测发现，成功实现Myc和Chemerin的融合表达；构建的pGL3b-chemerin-F1/F2/F3/F4四个报告基因载体均显示荧光素酶活性比对照组极显著增加（P<0.01）,F1和F3的启动子转录效率最高，pGL3b-chemerin-F1中的KLF5（Kruppel-like factor 5）结合位点定点突变后，pGL3b-chemerin-mutF1的荧光素酶活性极显著降低（P<0.01），在LMH细胞中干扰表达KLF5基因后，Chemerin基因的表达量极显著下降（P<0.01），初步证明在鸡Chemerin基因启动子区F1片段中存在正调控因子KLF5结合的顺式元件。本研究为进一步探讨鸡的Chemerin基因的功能提供了基础资料。
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