海口市培龙活禽市场家禽禽流感病毒携带情况分
禽流感病毒的流行给人类带来极大的危害。禽流感病毒传染性强、致病性强、病情发展快，一旦出现人感染禽流感病例，将会给人类健康带来巨大威胁。我国虽然已经在禽流感的致病、诊断及病原学等方面有了显著的成果，但是目前禽流感防控形势依然很严峻[1]。研究表明[2-4]活禽市场为禽流感病毒主要污染区，活禽市场暴露史或接触史成为人们感染禽流感病毒的一个重要因素。目前，我国大量研究[5-9]着重探究活禽市场外环境中禽流感病毒流行情况，而我们的研究则通过采集活禽的咽拭子、肛拭子来直接体现活禽禽流感病毒携带情况。海南省目前为止未发现人感染禽流感病例，也未有相关部门对活禽市场进行监测，为了解海口市活禽市场内家禽禽流感病毒携带情况，2017年1月—2018年12月对海口市培龙市场家禽进行咽拭子和肛拭子样品的采集，共600份，得到阳性样品的全基因组序列，为相关防控部门提供数据，以便其做好相应预防措施。报道如下。
1 材料与方法
1.1 采样方法
连续2年每月采集海口市培龙市场内家禽的咽拭子和肛拭子。每月采集25只家禽的咽拭子与肛拭子，包括鸡9只、鸭8只、鸽子8只，共50个拭子，25份样本（一只家禽采集的咽拭子和肛拭子为一份样本）。每个拭子放置到一个病毒分离采样管中。共采集600份棉拭子，包括鸡216份，鸭192份，鸽子192份。
1.2 试剂
病毒分离采样液包括10 g链霉素、12.5 g青霉素G钠盐、0.1 g硫酸庆大霉素、10 mL两性霉素B溶液、2.5 g Albumin Bovine V（BSA），均购自上海生工生物工程股份有限公司。另加入250mL已高压的40%甘油，用dulbecco's modified eagle medium（DMEM）培养基定容至1 000 mL备用。配制后测pH在7.0～7.5之间。病毒分离采样液按1.2 mL/支分装于2 mL RNaseFree EP管中。采集样本后，将样本置于-80℃保存，并尽快邮寄至深圳市疾病预防控制中心进行后续接种、鉴定及全基因组测序。
1.3 检测仪器及试剂盒
全自动核酸提取仪选用西安天隆科技有限责任公司的自动核酸提取仪。试剂盒采用南京诺唯赞生物科技有限公司的P611-01HiScriptⅡOne Step RT-PCR。
1.4 检测及分型鉴定方法
待检样品接种鸡胚后收获尿囊液提取核酸进行病毒鉴定；待检样品鸡胚接种后测定血凝效价，同时用PB1基因扩增来进行流感通用引物鉴定；对经鸡胚分离，禽流感通用引物PCR鉴定为阳性的病毒分离样本进行全基因组二代测序。
2 结果
2.1 禽流感病毒的阳性率
2017—2018年，从海口市培龙市场共采集600份样品，包括600份禽类咽/肛拭子，其中鸡216份，鸭192份，鸽子192份，检测出14份A型流感病毒核酸阳性，总阳性率 2.33%，2017年和2018年分别为 2.66%和2.00%。鸡的阳性率最高，达到3.70%，2017年和2018年分别为5.56%和1.85%；鸭的阳性率次之为2.08%，2017年和2018年均为2.08%；鸽子的阳性率为1.04%，2017年和2018年分别为0.00%和2.08%，见表1。
表1 2017—2018年活禽市场禽流感病毒阳性率2017年 2018年组别 采样数 阳性数 阳性率（%） 采样数 阳性数 阳性率（%）总体鸡鸭鸽子300 108 96 96 8 6 2 0 2.66 5.56 2.08 0.00 300 108 96 96 6 2 2 2 2.00 1.85 2.08 2.08
2.2 禽流感病毒亚型检出结果
从14个检出强阳性的样品中，检出4种HA亚型，不同亚型病毒检出率由高到低依次为H9（57.14%）、H3（21.43%）、H5（14.29%）、H6（7.14%）；检出 2 种 NA 亚型，N2（78.57%）、N6（21.43%）；H9N2 亚型检出率最高，占比57.14%，其次为H3N2占比21.43%。
2.3 不同亚型病毒在家禽中的分布
H9N2亚型病毒全部在鸡中检出；H3N2、H5N6、H6N6亚型病毒都有在鸭中检出。见表2。
表2 不同亚型病毒在家禽中的分布（n）?
2.4 不同月份的型别检出率
检出月份为10月份、11月份、12月份、1月份，集中在12月份和1月份，其中1月份阳性率最高达24%，12月份阳性率为16%，且这两个月份检出的亚型种类较多。见图1。
3 讨论
3.1 总体情况
图1 不同月份的型别检出率
2017年1月—2018年12月，持续对海口市培龙市场的鸡、鸭和鸽子进行样本采集，研究结果显示阳性结果数较少。究其原因：①海南省作为从未报道过人感染禽流感病毒的省份，人感染病毒几率低，病毒存在及流动较少；②可能与采样技术不够成熟有关；③未对环境混合样本进行采集。尽管如此，结果仍提示2017年和2018年该活禽市场内的家禽均携带有禽流感病毒，且主要集中在冬春季节。
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